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液相流動相稀釋劑的選擇

更新更新時間:2021-08-09

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                      液相流動相稀釋劑的選擇

                                                               上海連橋生物科技有限公司

稀釋劑的選擇

分析方法開發(fā),如何確定稀釋劑,確保方法的適用性。

1、稀釋劑的干擾

選擇稀釋劑,首先應考慮采用流動相體系,應關注以下幾點:

稀釋劑不得干擾已知雜質及主峰的檢測。

根據化合物的溶解特定,可適當加入助溶劑,但最好控制在5%以內,避免強溶劑效應。

允許對照品溶液與供試品溶液配制方式有差異,但對照品所添加的助溶劑一般應控制在2%以內,必免溶劑效應產生不良影響(如峰型、保留時間、峰響應等與供試品有差異,導致無法準確定量)。

2、關注各雜質及主成分的溶解度

通常有關物質方法中主成分的濃度較大(1mg/ml~10mg/ml),若主成分在稀釋劑中的濃度接近其飽和溶解度,可能出現(xiàn)以下三種情況:

供試品提取不充分,導致雜質測定結果偏低,部分未知雜質存在無法檢出風險。

供試品提取重現(xiàn)性差,導致雜質測定結果重現(xiàn)性差。

樣品在檢測過程中有析出,存在影響雜質準確定量的風險。

因此在進行方法摸索時,需測定相關主成分在稀釋劑中的飽和溶解度,最好滿足飽和溶解度大于3倍的供試品濃度。

3、關注各雜質及主成分的穩(wěn)定性

基于雜質譜分析,配制混標,考察混標中各雜質及主成分的穩(wěn)定性。

部分雜質峰面積明顯降低,可根據該類型化合物的結構特點,調整稀釋劑的組成或注明供試品溶液的保存條件(如避光、冷藏等)。

部分雜質峰面積明顯升高,結合主成分的結構特點,調整稀釋劑的組成或注明供試品溶液的保存條件(如避光、冷藏等)。

“臨用新制",應注明時間,確保測定數(shù)據的準確性。若穩(wěn)定性小于方法運行時間,個人認為是不可接受的。

4、關注溶劑效應

溶劑效應原定義為溶劑對于反應速率、平衡甚至反應機理的影響。針對于分析方法,主要指的是對溶解平衡的影響,涉及稀釋劑與流動相、流動相與固定相。

4.1、稀釋劑選擇不當引起的溶劑效應-現(xiàn)象及原理

樣品溶液的溶劑強度強于流動相溶劑強度時可能會造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象,其過程為當溶解樣品的溶劑不同于流動相時,樣品溶劑與流動相發(fā)生混合,樣品溶劑被沖稀。如果進樣溶劑之強度高于流動相,樣品在瞬間會表現(xiàn)為在較強溶劑中,并以較快速度通過色譜柱。色譜行為就是∶色譜峰的保留時間縮短。`當進樣溶劑與流動相混合時,一部分分子會先與流動相混合,致使這些分子通過色譜柱的速度發(fā)生變化,使峰形扭曲,發(fā)生變形。

4.2、稀釋劑選擇不當引起的溶劑效應-如何判定

通過HPLC儀器比對一下兩個劈叉峰的紫外吸收波譜,第一就是通過HPLC儀器比對一下兩個劈叉峰的紫外吸收波譜,看看他們是否能*一樣的μV特征吸收,第二將進樣體積調節(jié)到0.1μl看看,峰是否好轉,如果滿足上面兩個條件幾乎就可以肯定是100%的溶劑效應。

4.3、稀釋劑選擇不當引起的溶劑效應-如何避免降低稀釋的強度(如增加水相比例、調整pH等)或更換稀釋劑為流動相,2、在保證檢測靈敏度的前提下,降低進樣量。3、增加峰形前延抑制器,峰形前延抑制器的設計原理是,在色譜柱前端引入一個大小合適的空腔,使樣品到達色譜前被存留于空腔內的流動相(色譜柱平衡時流動相會充滿空腔)稀釋,使樣品溶劑"經稀釋后更接近流動相的組成,實現(xiàn)樣品溶劑與流動相的組成接近",并取代用流動相溶解樣品"的解決方案。

4.4、基質效應(溶劑效應的一個變種)

基質效應是指檢測系統(tǒng)檢測樣品中的分析物時,處于分析物周圍的所有非分析物質對分析物測定的影響。產生基質效應的原因與以下四個因素有關:儀器的設計、試劑的組成成分、測試方法的原理、質控材料的組成及處理技術等,通過回收率可以評估分析方法是否受基質效應的影響,一般若回收率普遍偏低、偏高或波動較大,建議考慮基質效應的影響。


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酶標儀的選擇

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