酶標(biāo)儀的選擇

上海連橋生物科技有限公司

一、濾片Vs光柵

　　多功能酶標(biāo)儀的分類方法眾多，但zui簡單的莫過于用他們的濾光方式來作分界線。一般來說，可以分為濾光片型和光柵型兩大類。當(dāng)然也有一些型號，例如Synergy4和EnVision等，一臺機(jī)器里面同時裝上了濾光片和光柵。但是濾片和光柵并不能同時完成同一個檢測，還是想用光柵的時候用光柵，該用濾片的時候用濾片;還有一些實(shí)驗(yàn)非用其中一個不可，另一模塊實(shí)現(xiàn)不了的。所以這類儀器本質(zhì)上還只是把濾片和光柵放在了一起，并沒有使兩者糅合而產(chǎn)生新的技術(shù)突破。

　　總體來說，濾片技術(shù)由于發(fā)展已久，配合二向色鏡(其實(shí)也就是另一模式的濾光反光濾鏡)等光路系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)大部分實(shí)驗(yàn)的需要。目前常規(guī)多功能酶標(biāo)儀中高的檢測靈敏度就是用濾光片型做出來的，例如TECAN Infinite F500的熒光檢測的靈敏度可以達(dá)到0.04 fmol/孔(熒光素，384孔/80ul)。

　　但是濾光片型儀器由于受限于濾片的波長和數(shù)量限制，不可能滿足日益增加的實(shí)驗(yàn)類型的檢測需要，而且有時需要對物質(zhì)的吸收、激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行研究，所以后來就誕生了光柵型的儀器。

　　最先推出光柵的是MD公司，其光柵習(xí)慣上稱為單光柵。由于光純度的不足，在光柵的后面又加入了一組帶阻濾片，再把雜光過濾一遍，達(dá)到了5×10^-4的雜光率，基本與純粹的濾光片系統(tǒng)一致。后來TECAN又發(fā)展出了雙光柵技術(shù)，通過兩次光柵濾光，雜光率降到了10^-6。后來，Thermo、BioTek和PE的部分新款儀器等都使用了類似雙光柵技術(shù)。由于激發(fā)和發(fā)射各用了一組雙光柵，此類機(jī)器又被稱為四光柵型多功能酶標(biāo)儀。

　　光柵型酶標(biāo)儀的推陳出新，使得用戶在波長選擇上不再受限，而且在雜光率、帶寬控制等性能上還超越了濾光片系統(tǒng)。例如，TECAN公司在2008年底推出使用了第三代四光柵系統(tǒng)的M1000酶標(biāo)儀，雜光率降到了2×10^-7的新低，還實(shí)現(xiàn)了帶寬2.5～20nm連續(xù)可調(diào)。這些都是目前濾光片型酶標(biāo)儀所不能或者較難實(shí)現(xiàn)的。

　　二、雜光率&波長準(zhǔn)確性

　　光柵型濾光系統(tǒng)儼然已經(jīng)成為了目前通用性多功能酶標(biāo)儀的主流，多家廠家共同努力，已經(jīng)把光柵技術(shù)推到了歷史新高。在光柵的眾多技術(shù)參數(shù)之中，最關(guān)鍵的無疑就是光柵的雜光率和波長選擇的準(zhǔn)確性了。

　　雜光率指得就是光源通過光柵后，得到的光線中，“不需要”的波長的光占所標(biāo)稱波長的光的比例，表征了濾光的純度。由于光線干涉、衍射等的復(fù)雜性，無論使用濾光片還是光柵，雜光都是不可避免的。各種濾光技術(shù)的本質(zhì)就是要想辦法把雜光盡可能地去掉。一般來說，濾光片型的雜光率在10^-4～10^-5之間，光柵型的可以做到10^-6～10^-7。由于此類雜光是非特異的，而且會直接進(jìn)入最后的檢測器，所以有多少的雜光就會引入多少的隨機(jī)誤差。在熒光等檢測過程中，由于檢測器存在放大效應(yīng)，雜光率的干擾也會被指數(shù)級放大。因此，雜光率就是一個濾光系統(tǒng)的首要性能指標(biāo)。

　　光柵的另一個重要指標(biāo)就是波長選擇的準(zhǔn)確性。因?yàn)楹芏鄼z測是依賴于物質(zhì)在某個波長的特征圖譜。就像DNA/RNA的OD260濃度測定，實(shí)際檢測波長偏離260nm幾個nm以上的話，OD值與最終濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系就會發(fā)生改變。因此，一組性能優(yōu)良的光柵系統(tǒng)，他的波長選擇準(zhǔn)確性應(yīng)該是在±0.5～1nm之間。波長偏離過大有時就會影響到最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　這兩個可謂是光柵甚至濾光片濾光系統(tǒng)最關(guān)鍵的技術(shù)參數(shù)，直接影響到的是得到數(shù)據(jù)是否是真正所要測量的結(jié)果，是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的最基本要求。

　　三、認(rèn)證>參數(shù)

　　在保證檢測可靠的基礎(chǔ)上，不同儀器的下一個差異就體現(xiàn)在檢測的靈敏度上面，這時人們關(guān)心的就是儀器能夠檢測到多弱的信號。

　　靈敏度涉及了整個光路系統(tǒng)的設(shè)計和選料，很難說某一個部件會起決定性作用。但是有一點(diǎn)，在各種單功能檢測項(xiàng)目中，光吸收檢測用非放大型的光電二極管、熒光檢測用光電倍增管、發(fā)光檢測用專門設(shè)計的單光子計數(shù)光電倍增管，這三種不同的檢測器是各自檢測領(lǐng)域的優(yōu)先選擇。

　　各單項(xiàng)檢測的*結(jié)果都是用相應(yīng)檢測器完成的。當(dāng)然也有的儀器出于成本等考慮，用一個檢測器兼容多種檢測模式，這在一定程度上也能完成實(shí)驗(yàn)需求，但是在性能上也會有所犧牲折中，無法實(shí)現(xiàn)各項(xiàng)檢測都達(dá)到*化。

　　關(guān)于靈敏度的定義和檢測標(biāo)準(zhǔn)，每個廠家都有各自的描述，都會說自己是怎樣怎樣好，很難有一個直觀的客觀比較。因此，某些試劑廠家就站了出來，對某些儀器的檢測性能提供一個第三方的認(rèn)證。

　　比較常見的是發(fā)光檢測領(lǐng)域里面的Promega公司DLReady認(rèn)證，熒光檢測領(lǐng)域的Invitrogen公司的LanthaScreen系列認(rèn)證、Cisbio公司的HTRF認(rèn)證、BellBrook實(shí)驗(yàn)室的Transcreener認(rèn)證等等。這些認(rèn)證主要是針對公司提供的某一類型的要求較高的試劑盒，涵蓋了對檢測儀器的各種性能要求，包括：檢測方法是否能用，靈敏度、線性范圍、孔間干擾等是否滿足要求等等。

　　如果需要做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，例如做Luciferase發(fā)光檢測的就看看儀器是否有DLReady認(rèn)證、做TR-FRET的就看看HTRF認(rèn)證、做FP就看看Transcreener認(rèn)證，如果機(jī)器擁有相關(guān)的認(rèn)證，就可以說明該機(jī)器在一定程度上能夠較好地滿足類似檢測的各種需求，遠(yuǎn)比單單比較一個靈敏度參數(shù)更能說明問題。因?yàn)橐粋€實(shí)驗(yàn)?zāi)芊褡龊貌⒉皇菃螁我粋€靈敏度就能表征的。

　　需要特別注意的是，LanthaScreen是一個系列的認(rèn)證，涵蓋了FI、FRET、TRF、FP等多個子項(xiàng)目，不同儀器所通過的子項(xiàng)目是不一樣的，需要上Invitrogen網(wǎng)站仔細(xì)查詢核對。

　　光柵型的儀器由于新技術(shù)近幾年才逐漸興起，受限于技術(shù)研發(fā)和儀器成本，同一個價格范圍內(nèi)的靈敏度等指標(biāo)會略差于發(fā)展成熟的濾光片機(jī)器。所以，在中檔多功能酶標(biāo)儀領(lǐng)域，拿到了各種認(rèn)證的光柵型儀器并不多見。而作為新一代光柵型酶標(biāo)儀的代表作，TECAN M1000已經(jīng)拿到了全部上述四種認(rèn)證，而且在靈敏度等單項(xiàng)性能上也已經(jīng)超越了不少的中g(shù)ao端濾片型酶標(biāo)儀。

　　這說明了光柵型酶標(biāo)儀的研發(fā)又進(jìn)入了一個新的高度，除了在靈活性上取得了無可ti代的作用外，還在檢測靈敏度等方面也逐漸替代傳統(tǒng)的濾光片型酶標(biāo)儀。光柵型是科研領(lǐng)域多功能酶標(biāo)儀的未來主要發(fā)展趨勢;而濾光片型儀器也正在往單項(xiàng)性能更優(yōu)的方面改進(jìn)。

　　四、比色杯+微量檢測

除了常規(guī)的6～384/1536孔酶標(biāo)板檢測之外，有些儀器還附帶了比色杯、微量檢測板等的兼容功能。無論是使用立式比色杯、臥式比色杯還是各種微量檢測板，其目的都是給光程不固定的酶標(biāo)板檢測引入一個標(biāo)準(zhǔn)光程的概念。雖然酶標(biāo)板檢測也能通過光程校正等方式實(shí)現(xiàn)10mm光程OD值的換算，但這只是一個數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換過程，檢測誤差累積較多，實(shí)際使用效果不佳。引入比色杯和微量檢測板后，光吸收的檢測光程就被固定在10mm或者0.5mm等的標(biāo)準(zhǔn)長度，OD值換算更加簡單和準(zhǔn)確。附帶了此類檢測功能的酶標(biāo)儀，相當(dāng)于除了本身的多功能酶標(biāo)檢測之外，還能替代部分分光光度計的功能，使其功能更加全面，儀器的性價比更高。

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